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學習重點 掌握逆相層析的基本方向：分析物通常越疏水、非解離比例越高，滯留越強；移動相有機溶劑比例越高，通常越快沖提。 先分辨弱酸、弱鹼或中性物質，再以移動相 pH 與 pKa 判斷解離比例，不能只背「升高 pH」的單一效果。 區分滯留時間與滯留因子：降低流速可延長滯留時間，但不代表分析物與固定相的作用變強。 綜合判讀固定相、溶劑種類與比例、流速、溫度及管柱長度；比較多項條件時，不可只看 C18 或 C8。 理解緩衝液加入有機溶劑後的 pH 變化，以及中性物質對 pH 通常較不敏感的原因。 核心觀念 一、逆相系統：固定相疏水，增加有機相通常加速沖提 C18 又稱 ODS，與 C8 都是逆相層析常用的疏水性固定相。一般在其他條件相近時，C18 對疏水性分析物的滯留通常較 C8 強。移動相常由水或緩衝液搭配乙腈、甲醇組成；提高有機溶劑比例，通常使滯留時間縮短；提高水相比例，通常使滯留時間延長。 相同體積比例下，乙腈在逆相系統中的沖提能力通常比甲醇強，因此改用甲醇通常較能延長滯留。此為常用判斷趨勢，實際選擇性仍與分析物及固定相有關。 Hydrocortisone 在常見分析條件下可視為不易解離的中性類固醇。比較其分析條件時，應優先辨認有機相比例與溶劑種類：水相占 70％、搭配沖提力較弱的甲醇（C8 管柱）的條件，滯留最長；有機相占 75％的條件即使使用 C18，仍會較快沖出。不能看到 C18 就直接判定滯留最長；大幅改變移動相組成，可能蓋過碳鏈長度的影響。 二、弱酸與弱鹼的 pH 判斷方向相反 一般逆相分配模式下，非解離型較疏水，較易留在固定相；離子型較易留在水性移動相，通常較快沖出。判斷前，須先確認 pKa 對應哪一組酸鹼平衡。 比較項目弱酸 HA弱鹼 B，其共軛酸為 BH⁺ 解離關係[A⁻]／[HA]＝10 的（pH－pKa）次方[B]／[BH⁺]＝10 的（pH－pKa）次方 pH 低於 pKa非解離 HA 增加，通常滯留較長帶正電 BH⁺ 增加，通常滯留較短 pH 高於 pKa帶負電 A⁻ 增加，通常滯留較短非解離 B 增加，通常滯留較長 pH＝pKaHA 與 A⁻ 各占 50％B 與 BH⁺ 各占 50％ pH 與 pKa 相差 1 時，兩型態約為 10：1；相差 2 時約為 100：1。接近 pKa 的區間，改變 pH 對解離比例及滯留通常最敏感；遠離 pKa、已幾乎完全呈同一型態時，再改變 pH 的影響通常較小。 三、弱酸藥物：酸化通常增加滯留 Aspirin 的 pKa 為 3.5，移動相由 pH 3 提高至 5 時，陰離子比例增加，逆相滯留時間縮短。對 pKa 為 4 的弱酸，在 pH 3、6、7、8 中，以 pH 3（低於 pKa）較有利於維持非解離型及適當滯留，為最適當的移動相 pH。 Ibuprofen 的 pKa 為 4.4，pH 4 至 5 跨越 pKa，解離比例改變明顯，對滯留時間影響最大。相較之下，pH 2 至 3 主要仍為非解離型；pH 6 至 7 或 8 至 9 主要已為離子型，因此這些區間的滯留變化通常較小。 Paracetamol 的酚性羥基呈弱酸性，pKa 約 9.5。在所列條件中，以乙酸水溶液搭配乙腈較適宜，可維持其主要為非解離型，也避免不必要的強酸、強鹼條件。NaOH 或 pH 10 的 borate buffer 已高於其 pKa，會增加離子型比例，且矽膠基質 ODS 管柱不耐強鹼；0.1 N HCl 酸性過強，也不利於管柱的鍵結相穩定。 四、弱鹼藥物：酸化通常縮短滯留 Bupivacaine、pentycaine、prilocaine 與 procaine 等含鹼性胺基的藥物，降低 pH 會增加 BH⁺ 比例，通常縮短逆相滯留。因此，bupivacaine 在 pH 8.4 時，改為 pH 7.4 通常不利於延長滯留；由 pH 9 的 Tris 改成 pH 5 的乙酸緩衝液，也會使其更快沖出，無法延長滯留。若要延長其滯留，可降低乙腈比例、使用更長的管柱或降低流速。 Pentycaine 的 pKa 為 8.1，在 pH 8.5 時繼續提高 pH，會增加非解離型，使滯留延長而無法縮短滯留；若要縮短滯留，可提高乙腈比例、使用酸性緩衝液，或提高分析溫度。 固定 pH 下，弱鹼的 pKa 越高，質子化比例越高。依本單元以解離程度為主要判斷依據的設定，procaine 的 pKa 為 9.0，在 pH 8.4 或 7.4 時，較 prilocaine（7.9）、bupivacaine（8.1）、morphine（8.4）更容易呈帶電型，故判為滯留最短。實際比較不同結構藥物時，不能單憑 pKa 保證滯留順序，還須考量本身疏水性與其他作用，但作答時依 pKa 判斷即可。 若 pH 由 8 降至 7，procaine（pKa 9.0）原本即已約九成質子化，降至 pH 7 後約為九成九，比例變化小；而 pKa 接近 8 的 bupivacaine、pentycaine、prilocaine 正處於解離比例變化最劇烈的區間。因此 procaine 的滯留時間受影響最小。 五、流速、溫度與管柱長度 滯留因子 k＝（tR－t₀）／t₀，其中 tR 為滯留時間，t₀ 為未滯留物通過管柱的時間。其他條件固定時，降低流速會使 t₀ 與 tR 一起增加，k 通常近似不變。例如流速由 1.0 降至 0.8 mL/min，滯留時間約變成原來的 1.25 倍；原為 17.32 分鐘時，約增至 21.65 分鐘。在提高乙腈比例、升溫、將 pH 降至 7.4 等選項中，只有降低流速能使 bupivacaine 滯留時間變長。 增加管柱長度通常也會延長滯留時間。升高溫度則會使移動相黏度下降、分析物在固定相的分配減少，逆相滯留縮短。 比較兩張層析圖時，若第二張圖的波峰滯留時間較第一張延長，可行的操作包括：降低有機相比例、降低流速、更換管柱（可能改變滯留與選擇性）；升高管柱溫度只會使滯留縮短，絕對無法造成滯留延長的層析圖。 六、混合溶劑的 pH 與中性物質 乙酸緩衝液加入乙腈後，溶劑介電常數降低，弱酸（乙酸）的解離受到抑制、表觀 pKa 上升，因此pH 值增加。不能認為緩衝液的 pH 維持不變，也不是隨乙腈比例增加而降低。配製時還須分清所標示的是加入有機溶劑前的水相 pH，還是混合後的量測值。 對在操作範圍內不解離的中性待測物，改變 pH 沒有明顯的解離效應。因此，相較流速、移動相組成及黏稠度，pH 是對其滯留時間影響最小的因素。 常考陷阱 「提高 pH 都會縮短滯留」：只適用於弱酸；弱鹼相反（提高 pH 使滯留延長），中性物質則幾乎不受影響。 「提高乙腈比例可延長逆相滯留」：方向相反；有機相增加加強沖提，使滯留縮短。 「C18 管柱一定滯留最長」：須同時看有機相比例與溶劑種類；高比例有機相的 C18 條件，滯留可能比高水相的 C8 條件短。 「C18 是正相固定相」：C18／ODS 屬逆相固定相。 「HPLC 紫外光檢測器通常用氙燈」：UV 檢測器光源通常為氘燈。 「降低流速表示滯留能力增強」：時間變長不等於 k 增大；但題目問「滯留時間」時，降低流速確實能延長。 「弱鹼改用酸性緩衝液可延長滯留」：酸化使弱鹼質子化帶電，滯留反而縮短。 「升溫可讓滯留變長」：升溫在逆相中使滯留縮短，若層析圖顯示滯留延長，升溫絕對無法達成。 「pH 改變幅度相同，影響就相同」：要看是否跨越或接近 pKa，以及起始時是否已幾乎完全解離。 「乙酸緩衝液加乙腈，pH 不變或下降」：正確為 pH 上升。 「弱酸用強鹼或強酸移動相最好」：強鹼使弱酸解離且傷管柱，強酸也損害鍵結相；以弱酸性的乙酸條件為宜。 記憶口訣 「酸遇酸留，鹼遇酸走；有機加多，通常快走。」弱酸在酸性下較不解離而滯留，弱鹼在酸性下帶電而快沖出。「接近 pKa，改變最敏感；流速降下來，時間拉長開；溫度升上去，峰往前面跑。」「乙腈加進醋酸緩衝，pH 往上衝。」