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學習重點 掌握螢光與磷光的電子躍遷差異，理解一般螢光的激發波長較短、放射波長較長（Stokes位移）。 辨認螢光儀的兩段選光裝置：樣品前選擇激發光，樣品後選擇放射光。螢光光譜儀用兩個單光器，濾鏡螢光測定計用兩個濾鏡。 理解偵測器通常與激發光成90°，目的是避免透射光干擾螢光測定，不能宣稱能避免散射光干擾。90°配置也必須搭配四面透明的樣品槽。 比較氙弧燈、汞蒸氣燈、染料雷射與氘燈，掌握螢光測定需要高強度激發光，因此氘燈最不適用。 連結分子剛性、濃度及氧化還原狀態與螢光強度，尤其注意核黃素本身有螢光、還原後螢光消失。 核心觀念 一、螢光與磷光：都是發光，但返回基態的途徑不同 分子吸收適當波長的光後，電子由基態進入激發態。激發分子可以經由不放光的途徑消耗能量，也可以放出光子返回基態。螢光分析測定的就是激態電子返回基態時所發散出的光，可用來鑑別或定量分析物。 比較項目螢光磷光 典型發光躍遷激發單重態返回基態單重態激發三重態返回基態單重態 主要途徑吸光後經振動鬆弛等過程，再放出螢光先經系間跨越形成三重態，再放出磷光 放光特性速度快，停止激發後迅速衰減涉及自旋禁制躍遷，壽命較長，可有餘輝 作答時，「激態電子返回基態而放出光」符合螢光的基本概念。若題目要求比較螢光與磷光，則應看單重態、三重態及自旋變化，不能只以是否發光來區分。 二、Stokes位移：先損失部分能量，再放光 分子吸收激發光後，會先經振動鬆弛、溶劑鬆弛等過程損失部分能量。因此放出的螢光光子能量通常比吸收的光子低。依E＝hc／λ，能量較低代表波長較長，所以通常激發波長＜放射（發散）波長。 激發光譜與放射光譜之間的這種位移稱為Stokes位移。儀器可藉此用放射端的選光裝置，把螢光與激發光區分開來。題目以「通常」或「一般」描述波長關係時，應依此原則判斷。 三、儀器光路：樣品前、後各有一道選光裝置 典型螢光光譜儀的光路為：光源→激發單光器（第一單光器）→樣品槽→放射單光器（第二單光器）→偵測器。放射光沿著與入射激發光成90°的方向收集，各元件並非排成一直線。 激發單光器：位於樣品前，從光源中選出適當波長，讓分析物受到激發。 放射單光器：位於樣品後、偵測器前，選出欲測量的螢光波長，減少其他波長光線的干擾。 偵測器：常用光電倍增管，將微弱螢光轉換為電訊號。 因此，螢光光譜儀具有兩個單光器是正確敘述。濾鏡螢光測定計則由光源、第一濾鏡（選激發光）、貯液管、第二濾鏡（選螢光）與螢光偵測系統組成。兩者都是「兩段選光」，差別只在使用單光器或濾鏡。 辨識裝置圖的判斷要點： 樣品前、後各有一個單光器或濾鏡。 偵測器位於樣品側面，與入射光成直角。 具備以上兩點，即為螢光光譜儀。 其他儀器的對照如下： 紫外光－可見光光譜儀：只有一個單光器，光源、單光器、樣品、偵測器排成一直線，測量透射光。 核磁共振光譜儀：以磁鐵與射頻線圈為主體，不使用光學單光器光路。 拉曼光譜儀：雖然也可能側向收光，但通常以雷射為光源，且不需要激發端單光器。 四、90°收光與樣品槽：目的是避免透射光干擾測定 激發光穿過樣品後，透射光主要沿原方向前進，強度遠大於螢光。把偵測器安置在與激發光成直角的線上，可避免強烈的透射光直接進入偵測器，干擾微弱螢光光度的測定。 這個設計影響的是「測定」，有兩點要分清楚： 它不會影響螢光的「產生」。分子會不會發螢光，與偵測器擺在哪個方向無關。 它也不是為了刻意增加或降低螢光測定值，而是為了排除背景光、提高訊噪比。 散射光（如Rayleigh散射、拉曼散射）會向各方向傳播，仍可能進入90°光路，因此必須靠放射單光器或濾鏡加以排除。直角配置不能解釋成「可避免散射光之干擾」。 由於激發光與螢光從不同方向通過槽壁，螢光用的樣品貯液槽須四面透明。紫外光吸收用的樣品槽則常只有兩面透光。涉及紫外光激發時，通常使用石英槽。 五、激發光源：需要高強度與合適波長 螢光強度與激發光強度成正比。螢光又是微弱訊號，因此光源必須在所需激發波長提供足夠高的光強。 光源特性與判讀重點 氙弧燈（Xenon arc lamp）強度高、波長涵蓋紫外至可見光的連續光譜，是螢光光譜儀最常用的光源，適合搭配單光器掃描。 汞蒸氣燈（Mercury vapor lamp）具強烈的特徵線光譜，常用於濾鏡螢光測定計；分析物的激發波段與譜線配合時，即可作為激發光源。 染料雷射（Dye laser）強度極高、窄頻，且波長可調，適合高靈敏度螢光測定。 氘燈（Deuterium lamp）主要作為紫外光吸收光譜的連續光源，但輸出強度遠低於氙弧燈，最不適用為螢光光譜法之燈源。 判斷光源不能只看「是否能發出紫外光」。能用於紫外吸收測定，不代表適合作為螢光激發光源，關鍵在於光強是否足夠。 六、波長選擇、分子結構、濃度與核黃素 激發光譜是在固定放射波長下掃描激發波長。放射光譜是在固定激發波長下掃描放射波長。激發波長及發射波長都可以經掃描選出最佳值，以提高靈敏度及專一性。可選擇兩種波長，正是螢光法專一性優於吸收法的原因。 剛性（rigid）較高的分子結構較有利於螢光放射，例如稠環芳香族化合物。分子內部轉動、振動等不放光的能量消耗途徑受到限制，能量就較容易以放光方式釋出。 在適當的低濃度範圍內，其他條件固定時，濃度越高，螢光強度越大，兩者近似成正比。濃度過高時，會出現內濾效應、自吸收或濃度淬熄，線性關係就不成立。因此線性只在一定範圍內成立，不是越濃越好。 核黃素（維生素B2）本身即具有黃綠色螢光。加入低亞硫酸鈉（sodium hydrosulfite，亦稱連二亞硫酸鈉）會使它還原為無螢光的還原型。實務上，可先測樣品螢光，再加入低亞硫酸鈉測得空白值，兩者相減以扣除背景。必須記成「還原後螢光消失」，不能記成「還原後才有螢光」。 常考陷阱 「激發與放射光垂直排列可避免散射光之干擾」（錯）：散射光會向各方向傳播，90°配置仍會收到。直角配置的目的是避免透射光干擾。 「偵測器成直角是為了避免透射光干擾螢光之產生」（錯）：受影響的是螢光的「測定」，不是「產生」。 「避免激發光通過，以增加（或降低）螢光測定值」（錯）：直角配置不是用來改變螢光值的大小，而是排除透射光背景。 「入射光與發散光呈45°」（錯）：一般螢光儀的光源入射光與偵測方向呈90°。 「一般激發光源與偵測器呈90度」「樣品貯液槽四面透明」（對）：兩者互相呼應，都是正確敘述，不要誤判為錯誤選項。 「儀器具有兩個單光器」（對）：螢光光譜儀有激發與放射兩個單光器，紫外光－可見光光譜儀只有一個。 「放射光波長比激發光短」（錯）：一般情況正好相反，激發波長較短、放射波長較長。 「氘燈適合作螢光光源」（錯）：氘燈強度不足，在氙弧燈、汞燈、染料雷射、氘燈中最不適用。 「核黃素須加低亞硫酸鈉還原才有螢光」（錯）：方向顛倒。核黃素本身有螢光，還原後螢光消失。 「剛性結構較利於螢光放射」「適當濃度下濃度越高螢光越強」（對）：注意「適當濃度」這個前提，過濃時會發生淬熄。 裝置圖辨識：樣品前後各有一個單光器、偵測器在側面成直角，即為螢光光譜儀；不要誤選紫外光－可見光光譜儀或拉曼光譜儀。 記憶口訣 「激短放長、雙光器；直角避透，散射靠單光。」激發波長短、放射波長長；螢光儀有激發、放射兩個單光器。90°配置避免透射光干擾測定，散射光則要靠單光器排除。 「氙汞雷射都能照，氘燈太暗不能要。」氙弧燈、汞蒸氣燈、染料雷射都可作螢光光源；氘燈強度不足，最不適用。 「剛性利發光，核黃還原就熄光。」剛性結構有利螢光；核黃素本身會發螢光，加低亞硫酸鈉還原後螢光消失。