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學習重點 掌握螢光的本質：螢光測定的是激發態電子返回基態時「放出」的光。放射波長通常比激發波長長；螢光激發態的壽命比磷光短。 判斷螢光強弱的原則是「剛性與共軛有利，碰撞與非輻射失活不利」。依此推論分子結構、溫度、黏度及溶媒的影響。 螢光強度只在適當的低濃度範圍內與濃度近似成正比。濃度過高會使誤差增加，因此檢品濃度常為吸光度法的 1/10～1/100。 區分重原子、錯合、散射及淬熄的差異，並記住 riboflavin、thiochrome 與 ethinylestradiol 這三個常考實例。 核心觀念 一、螢光是放射光譜，測定的是放光 分子吸收適當波長的光後，電子由基態進入激發態。電子返回基態時，部分能量以光的形式釋出，這就是螢光。吸收光屬於激發過程，放出的光才是螢光測定的對象，因此螢光光譜是發射光譜。分子在放光前通常已經由振動鬆弛等過程失去部分能量，所以螢光光子的能量較低，放射波長通常較激發（入射）波長長，這稱為 Stokes 位移。 一般有機分子的螢光，來自單重激發態返回基態。磷光則來自三重激發態，這種躍遷較不容易發生，因此螢光激發態的持續時間比磷光短。 螢光分光光度計常用氙弧燈作為光源，鎢絲燈並非其典型光源。溶液測定時，偵測器設在與入射光呈直角的方向，以減少透射光直接進入偵測器。不過，直角配置仍無法排除散射干擾。 二、分子結構：共軛、平面與剛性有利螢光 具有芳香環或延伸共軛系統（π 電子系統），且骨架呈平面、剛性的化合物，較容易產生螢光。剛性結構能限制分子的旋轉與振動，減少能量經非輻射途徑消耗，使放光機會增加。在考試中，「具螢光之化合物需為剛性骨架」被視為正確敘述。發色團與助色團會改變電子分布、吸收及放射性質，因此螢光強度與發色團、助色團有關。 要分清發色團與助色團的角色。螢光結構要件的正確說法是「延伸共軛的發色團＋平面剛性結構」。若寫成「必需具有延伸性助色團」，就是用詞錯誤：助色團只負責修飾光譜，並不會「延伸」。 許多酚類化合物具有螢光，例如雌激素類。樟腦（camphor）缺乏芳香環及延伸共軛系統，不能直接用螢光法分析。分子中含有羰基，不代表就具有螢光。 三、溫度與溶媒：決定分子如何消耗激發能量 影響因素一般趨勢判斷理由 溫度升高螢光減弱分子運動及碰撞增加，非輻射失活更容易發生。 溫度降低螢光增強碰撞減少，非輻射能量損失也隨之減少。 溶媒黏度增加螢光增強分子運動及碰撞受到限制，非輻射失活降低。 溶媒種類改變強度與波長均可能改變極性、氫鍵及溶質與溶媒間的作用，會影響激發態。 所以溫度、黏度及溶媒種類都會影響螢光測定值。實際定量時，標準液與檢品液必須維持相同的溫度、溶媒組成及測定條件。 四、pH：改變酸鹼型態，也可能改變螢光 pH 會改變分析物的質子化或解離狀態，進而影響共軛及電子分布。不同的酸鹼型態，可能有不同的激發波長、放射波長與螢光強度，因此螢光強度會受 pH 影響，而且不能概括說酸性或鹼性一定有利於螢光。 Ethinylestradiol：結構中的酚性基團與其螢光有關。加入1 M 氫氧化鈉後，酚羥基解離成酚鹽，螢光隨之消失。在鹽酸、磷酸等酸性條件或甲醇中，則不會使螢光消失。 Thiamine 與 thiochrome：thiamine 在鹼性條件下以氧化劑（如鐵氰化鉀）氧化，經氧化閉環生成具強螢光的 thiochrome，這是螢光衍生化分析的典型例子。「閉環」發生在 thiochrome 生成時，是「產生」螢光的步驟。若說「酸化後因閉環而失去螢光」，就是錯誤敘述。 五、濃度與入射光：低濃度才有良好線性 螢光強度受入射光強度、吸收程度及螢光量子產率影響。濃度夠低且其他條件固定時，可近似表示為 F ∝ I₀εbcΦ。因此螢光強度與入射光強度有關，並且在低濃度範圍內與濃度近似成正比。 濃度過高時，激發光在溶液前端就被大量吸收；放出的螢光也可能再被溶液吸收，這稱為內濾效應與再吸收。分子之間也可能發生自我淬熄。這些現象都會使校正曲線偏離直線，檢體濃度越高，誤差越大。所以濃度會影響測定，濃度也不是越高越好，螢光強度並非在所有濃度都與濃度呈直線關係。 螢光法的靈敏度比紫外光吸光度法高，可以使用更低的濃度。螢光測定的檢品濃度，常為吸光度測定的 1/10～1/100。 六、重原子、淬熄、錯合與散射 淬熄是使螢光減弱的過程。動態淬熄來自激發態分子與其他分子碰撞；靜態淬熄則是形成不發光的基態錯合物所致。分析物可能與溶液中的其他分子形成錯合物，進而影響螢光強度。 重原子效應會促進系間跨越，使能量轉向三重態途徑，因此螢光減弱。考試常以溶液中的氯離子、溴離子作為降低螢光的例子。溶液中含重原子或重金屬時，應判斷為使螢光降低，不會增強放射光。 Caffeine 會使 riboflavin 的螢光減弱，這是分子間作用造成淬熄的例子，不可記反成增強。 灰塵、懸浮粒子及其他微粒會散射光線，干擾微弱的螢光訊號，因此螢光法極易受這些微粒影響。散射屬於光學干擾，與分子淬熄不同。即使採用直角偵測，溶液與比色槽仍須保持潔淨。 常考陷阱 「測定激態電子返回基態所吸收之光」：把激發與放射混淆了。螢光測定的是「放出」的光。 「放射光波長較入射光短」：錯誤。螢光的波長較長、能量較低。 「溫度越高，螢光越強」：錯誤。升溫會減弱螢光，低溫則使螢光增大。 「螢光與黏度、溶媒或 pH 無關」：錯誤。黏度高會使螢光增強，溶媒與 pH 也都會影響螢光。 「濃度越高結果越好」「濃度與測定無關」「與濃度均呈直線」：都是錯誤敘述。高濃度會產生內濾效應及自我淬熄，誤差隨之變大。 「檢品濃度與吸光度法相同」或「為其 10～100 倍」：錯誤。正確為 1/10～1/100。 「重原子、重金屬使螢光增強」：錯誤。氯、溴等重原子會使螢光減弱。 「caffeine 使 riboflavin 螢光增強」：錯誤。實際上是減弱。 「不受懸浮粒子影響」：錯誤。微粒散射會干擾測定。 「螢光激發態持續時間比磷光長」：錯誤。螢光的壽命較短。 「光源使用鎢絲燈」：錯誤。螢光分光光度計常用氙弧燈。 「必需具有延伸性助色團」：用詞錯誤。應為延伸共軛的發色團配合平面剛性結構。 「thiochrome 酸化後因閉環而失去螢光」：錯誤。閉環發生在 thiochrome 生成時，是產生螢光的步驟。 Ethinylestradiol：加入強鹼 NaOH 使酚解離，螢光消失。加入酸或甲醇則不會使螢光消失。 可直接以螢光法分析樟腦：錯誤。樟腦缺乏共軛系統。 記憶口訣 「冷、黏、剛，螢光亮；熱、重、濃，螢光暗。」低溫、高黏度及剛性結構有利螢光；升溫、重原子（Cl⁻、Br⁻）及濃度過高，則會使螢光減弱或偏離線性。 「放光波長長，螢光壽命短；濃度百分一，直角仍防塵。」 「咖啡熄核黃；硫胺鹼氧閉環亮；炔雌遇鹼光消失。」