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學習重點 掌握液相層析－三段四極柱串聯質譜（LC-MS/MS）是藥物及代謝物血中濃度定量最常用的儀器。 理解串聯質譜的基本流程：選擇前驅離子、誘導碎裂、分析產物離子，並區分游離源與質量分析器。 比較三段四極柱與離子阱：前者擅長選定離子對進行定量，後者適合多階段碎裂（MSⁿ）與結構追蹤，常用氦氣作碰撞氣體。 辨認碰撞誘導解離（CID）的應用：不純物、降解產物結構解析、胜肽胺基酸序列分析、離子對定量；並記住它不能解析光學異構物立體結構，且再現性不佳、不適合建立通用圖譜資料庫。 核心觀念 一、LC-MS/MS 為何適合血中藥物定量？ 血液檢體含有蛋白質、脂質與其他內生性物質，分析時必須兼顧分離能力與偵測選擇性。液相層析先分離待測物及部分干擾物，串聯質譜再依前驅離子與產物離子的組合進行偵測，因此廣泛用於藥物及代謝物的血中濃度定量。 此類定量最常搭配三段四極柱質譜儀（triple quadrupole）。許多藥物及代謝物具有極性、不易揮發或受熱不穩定，適合液相層析分析；氣相層析通常要求待測物具有適當揮發性與熱穩定性，部分化合物還需衍生化。磁場式質譜儀體積大、價格高，不是常規血中濃度定量的主流。看到「藥物與代謝物血中濃度定量最常使用的儀器」，應選LC－三段四極柱 MS/MS。 二、串聯質譜的本質：先選離子，再看碎片 質量分析器依質荷比（m/z）區分離子。串聯質譜先選取特定的前驅離子（precursor ion，亦稱母離子），使其碎裂，再分析所生成的產物離子（product ion，亦稱子離子）。碎片的質量、組合及中性損失，可提供原分子結構線索。 串聯質譜的特色包括： 可選擇性地將特定分子（離子）片段化：只讓選定 m/z 的離子進入碎裂步驟。 可提供更多待測物結構相關的訊息：由碎片推回分子結構。 可多次片段化：例如對碎片再選取、再碎裂，將化合物片段化兩次、三次甚至更多次（MSⁿ）。 可提高分析靈敏度與選擇性：兩次質量篩選排除背景雜訊，提高訊雜比。 ESI（電灑游離）與 EI（電子游離）是游離方法，不是質量分析器。串聯質譜不是把 ESI-MS 與 EI-MS 兩台不同的質譜儀直接串接；其關鍵在於能依序進行「離子選擇 → 碎裂 → 質量分析」，可用多個分析器在空間上串連（如三段四極柱），也可在同一分析器內依時間順序完成（如離子阱）。 ESI 屬軟性游離，通常主要得到分子離子（如 [M+H]⁺），碎片資訊偏少。接上串聯質譜後，可針對選定離子進行碎裂，補足 ESI 碎裂資訊不足之處。因此 ESI 與三段四極柱結合，相較於單段四極柱、單段飛行時間或雙聚焦磁場式，能獲得最多分子結構資訊。 三、三段四極柱：以特定離子對進行選擇性定量 區段主要功能判讀關鍵 Q1篩選特定 m/z 的前驅離子決定讓哪一種離子進入碰撞區 q2作為碰撞池，使離子與惰性氣體碰撞而碎裂主要負責碎裂，並非再篩選一個特定 m/z Q3分析或篩選產物離子取得碎片資訊，或監測指定產物離子 定量時，選取特定的「母離子 → 子離子」轉換（transition）進行監測。監測單一組轉換稱為選擇反應監測（SRM）；同時監測多組轉換常稱為多重反應監測（MRM）。兩次質量選擇可降低基質背景干擾，提升定量的選擇性與靈敏度。 四、離子阱與多階段質譜：追蹤碎片的來源 離子阱（ion trap）可將離子儲存在阱內，依時間順序完成選擇、碰撞碎裂及分析，並可再選取某個產物離子繼續碎裂，反覆進行，稱為多階段質譜（MSⁿ）：MS² 為選取前驅離子碎裂後分析，MS³ 再選取 MS² 的某個碎片碎裂，依此類推。 分析 diphenhydramine 等藥物的氧化產物時，可比較原藥與氧化產物的逐級碎裂路徑，追蹤哪些碎片保留氧化造成的質量增加（如 +16），進而推定氧化位置。題幹出現多次碎裂（MSⁿ）、逐級追蹤結構或判斷修飾位置時，選離子阱質譜儀。單段飛行時間、磁場式、單段四極柱都不具備在同一儀器內反覆選取並碎裂的能力。 離子阱常使用氦氣（He）作為緩衝與碰撞氣體：氦氣可冷卻離子、使離子集中於阱中心，並在碰撞活化時促成碎裂。三段四極柱的碰撞池則常用氮氣或氬氣，不要混淆。 五、CID 的應用與判讀界線 碰撞誘導解離（collision-induced dissociation, CID）是使離子與中性惰性氣體碰撞，將部分動能轉為離子內能，促使化學鍵斷裂並產生碎片的方法。主要應用： 結構分析：提供不純物、降解產物及代謝物的碎裂片段資訊，協助解析其結構。 定量分析：選取特定母離子／子離子對進行偵測，增加血中藥物濃度定量的選擇性與靈敏度。 胜肽分析：胜肽骨架斷裂形成 b、y 系列離子，由相鄰離子的質量差推定胺基酸組成與序列。 CID 不能用來解析光學異構物的立體結構：對映異構物質量相同、碎裂行為幾乎一致，質譜無法區分，需搭配手性層析等方法。 CID 的再現性不佳：碎裂結果受碰撞能量、氣體種類與壓力、儀器型式等影響，不同儀器間圖譜差異大，因此不像 EI（標準 70 eV）圖譜適合建立通用的質譜資料庫。 測定蛋白質胺基酸序列：先以酵素（如胰蛋白酶）將蛋白質消化成胜肽，再以串聯式液相層析質譜法（LC-MS/MS）分離並分析碎片。聚丙烯醯胺膠體電泳（估分子量、分離）、超高速離心（依沉降分離）、快速蛋白質液相層析（FPLC，純化）都只能分離或純化，不能讀出胺基酸序列。 常考陷阱 「串聯質譜是將 ESI-MS 及 EI-MS 兩台不同質譜儀直接串聯」：錯。ESI、EI 是游離法；串聯質譜的本質是「選離子 → 碎裂 → 再分析」。 「串聯質譜可將化合物片段化三次」「可選擇性將特定分子片段化」「可提供更多結構訊息」：皆為正確敘述，不要誤判為錯誤選項。 「MS/MS 可提高分析靈敏度」「可補足電灑法碎裂資訊偏少」：皆正確；靈敏度提升來自背景雜訊降低、訊雜比提高。 「CID 再現性非常好，其質譜圖可供資料庫建置」：錯。CID 受操作條件與儀器影響大，再現性差；通用資料庫以 EI 圖譜為主。 「CID 可解析光學異構物的立體結構」：錯。對映異構物質量與碎片相同，CID 無法分辨。這是「非 CID 應用」題的標準答案。 「多次碎裂判斷氧化位置選 TOF、磁場式或四極柱」：錯。需要 MSⁿ 時選離子阱。 「離子阱碰撞氣體選氬氣」：錯。離子阱常用氦氣；氬氣、氮氣多見於三段四極柱碰撞池。 「ESI 搭配 TOF 或雙聚焦磁場式得到最多結構資訊」：錯。單段分析器只測 m/z，無串聯碎裂；應選三段四極柱。 「血中藥物定量最常用 GC 或磁場式質譜」：錯。應為LC－三段四極柱質譜。 「電泳、超高速離心、FPLC 可定胺基酸序列」：錯。這些只能分離純化，定序要靠串聯式 LC-MS。 記憶口訣 「血中定量液三極；一選母、二碰撞、三看子。」LC－三段四極柱定量；Q1 選前驅離子、q2 碰撞碎裂、Q3 分析產物離子。 「離子阱，留離子；選了碎，碎再選；阱內常用氦。」離子阱做 MSⁿ 多次碎裂、判斷修飾位置；碰撞氣體為氦。 「碎片看結構、胜肽定序列、離子對定量；光學立體撞不出，CID 圖譜難建庫。」