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學習重點 掌握 LDH 的可逆反應：乳酸與丙酮酸互相轉換，並伴隨 NAD+／NADH 的氧化還原。 依受質判斷反應條件：乳酸氧化測定採鹼性條件；丙酮酸還原測定約採 pH 7.4～7.5。 以 NADH 判斷吸光度方向：NADH 在 340 nm 有明顯吸收；生成時吸光度上升，消耗時下降。 分清濃度與活性測定：測乳酸或丙酮酸濃度時加入 LDH；測 LDH 活性時提供受質與輔酶，觀察反應速率。 熟悉方法差異與檢體處理：辨別 LDH 法、乳酸氧化酶法及 hydrazine 的作用，並注意低溫運送與迅速分離血漿。 核心觀念 一、LDH 催化的反應與輔酶 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH，亦稱 LD）催化下列可逆反應： 乳酸＋NAD+ ⇌ 丙酮酸＋NADH＋H+ 本單元將乳酸變成丙酮酸稱為正向反應：乳酸被氧化，NAD+ 被還原為 NADH。逆向反應則是丙酮酸被還原為乳酸，同時 NADH 被氧化為 NAD+，並消耗 H+。 LDH 所用的輔酶系統為NAD+／NADH，不是 FAD／FADH2，也不是 ATP 或 ADP。判讀時須注意反應方向：乳酸氧化需要 NAD+，丙酮酸還原需要 NADH。 二、受質、pH 與吸光度變化 測定方式受質及輔酶反應 pH340 nm 吸光度 以 LDH 測乳酸濃度乳酸、NAD+鹼性，8.8～9.8；常見 9.2 或 9.3NADH 生成，吸光度上升 以 LDH 測丙酮酸濃度丙酮酸、NADH約 7.5NADH 消耗，吸光度下降 以乳酸為受質測 LDH 活性乳酸、NAD+鹼性，例如 9.2 或 9.4吸光度隨時間上升 以丙酮酸為受質測 LDH 活性丙酮酸、NADH約 7.4吸光度隨時間下降 pH 7.4～7.5 配丙酮酸與 NADH；pH 9.2～9.4 配乳酸與 NAD+。因此，使用 pH 9.4 緩衝液測定 LDH 活性時，試劑應包含 NAD+。 鹼性條件有利於乳酸氧化方向的測定，但不能據此認為 LDH 在任何條件下都偏向乳酸生成丙酮酸。反應方向仍受 pH、受質與產物濃度影響。 三、340 nm 測定與定量原理 NADH 在 340 nm 有明顯吸光，NAD+ 在此波長的吸光度很低。因此，測定的是 NADH 的生成或消耗，並非乳酸或丙酮酸本身在 340 nm 的吸光。 乳酸氧化：生成 NADH，A340 上升。 丙酮酸還原：消耗 NADH，A340 下降。 測代謝物濃度時，加入足量 LDH 與所需輔酶，利用反應造成的 NADH 變化量定量；理想反應下，乳酸或丙酮酸與 NADH 的變化量具有一對一的莫耳關係。測 LDH 活性時，則在受質與輔酶足量的條件下，以每單位時間的吸光度變化量反映酵素活性，不能只看單一時間點的吸光度。 四、hydrazine 與乳酸測定配方 乳酸氧化測定可使用LDH、pH 9.2 緩衝液、hydrazine 與過量 NAD+。此配方測的是乳酸，因為 LDH 已由試劑提供，待測物是檢體中的乳酸。 Hydrazine 會與反應生成的丙酮酸形成衍生物，使可參與逆反應的游離丙酮酸減少，將反應推向乳酸氧化方向。它的角色是捕捉產物、促進反應進行，不是 LDH 輔酶，也不是直接產生 NADH 的物質。 五、LDH 法與乳酸氧化酶法 比較項目LDH 法乳酸氧化酶法 主要反應乳酸與 NAD+ 反應，生成丙酮酸與 NADH乳酸與氧氣反應，生成丙酮酸與過氧化氫 是否需加入 NAD+需要不需要 常見偵測方式測量 NADH 在 340 nm 的吸光度增加利用過氧化氫及過氧化酶，使呈色系統顯色 「乳酸氧化酶搭配 NAD+」是混用兩種方法的錯誤敘述。乳酸氧化酶法產生過氧化氫，再由過氧化酶催化呈色反應；LDH 法則追蹤 NADH 變化。 酵素分類上，LDH 屬於dehydrogenase（脫氫酶）。在本單元列出的酵素類別中，需要 NAD／NADH 參與者應選脫氫酶；但不能延伸成所有脫氫酶都只使用 NAD，有些脫氫酶使用其他輔酶。Oxidase 以氧作為電子接受者；peroxidase 利用過氧化物進行氧化反應；transferase 則催化官能基轉移。 六、正向與逆向 LDH 活性測定的比較 以乳酸為受質、觀察 NADH 生成的正向測定，與以丙酮酸為受質、觀察 NADH 消耗的逆向測定相比，本單元應掌握的主要優點是反應干擾較少。不可將主要優點替換成操作一定較簡便、試劑一定較穩定或價格一定較便宜。 七、採血與檢體處理 血液離體後，血球仍會進行糖解作用，使乳酸持續生成，造成測值偏高。測定丙酮酸的檢體應以冰浴或低溫方式運送，並於 15 分鐘內分離血漿，以減少細胞代謝造成的影響。 乳酸測定可使用含 NaF 的適當採血管。NaF 藉由抑制 enolase 降低糖解作用，但其抑制作用不是立即完全發生，因此不能因為使用 NaF 就忽略迅速處理檢體。NaF 主要是抗糖解成分，採血管的抗凝作用通常另由其他添加物提供。 八、丙酮酸羧化酶缺乏與乳酸／丙酮酸比值 丙酮酸羧化酶將丙酮酸轉成草醯乙酸，參與糖質新生與三羧酸循環中間物的補充。缺乏時可出現乳酸與丙酮酸代謝異常及乳酸酸中毒。 本單元須排除「丙酮酸羧化酶缺乏會使乳酸／丙酮酸比值下降」的敘述。但也不宜直接背成所有患者比值必定升高；比值受疾病型態及代謝狀態影響，可能正常或升高。由 LDH 反應可理解，此比值也與細胞內 NADH／NAD+ 的氧化還原狀態有關，不能只憑乳酸增加就推定比值必然上升。 常考陷阱 把 LDH 輔酶寫成 FADH2：應改判為 NAD+／NADH，並依反應方向選擇。 看到測乳酸就選中性 pH：乳酸氧化測定採鹼性，範圍為 8.8～9.8；約 7.4～7.5 對應丙酮酸還原。 正向反應寫成 A340 下降：乳酸變成丙酮酸會生成 NADH，吸光度應上升。 看到試劑含 LDH 就認為測 LDH 活性：還要看待測物；已加入 LDH、NAD+ 與 hydrazine 的配方可用於測乳酸濃度。 將 hydrazine 當輔酶或呈色劑：其重點是捕捉丙酮酸，推動乳酸氧化。 乳酸氧化酶法也需 NAD+：此法利用氧氣並產生過氧化氫，須與 LDH 法分清楚。 使用 NaF 後即可延遲分離：抗糖解添加物不能取代迅速處理與適當低溫運送。 正向法優點選價格或穩定性：本單元比較的主要優點為反應干擾較少。 記憶口訣 「乳氧酮還原，九鹼七近中；乳生 NADH 光升，酮耗 NADH 光降。」 「脫氫看 NAD，氧化看氧氣；hydrazine 抓丙酮，正向干擾較少記。」