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學習重點 等電點（pI）是蛋白質所帶正、負電荷總量相等，平均淨電荷為零時的 pH，不代表所有官能基都不帶電。 比較環境 pH 與蛋白質 pI，即可判斷淨電荷與電泳方向：pH 大於 pI，帶負電往陽極；pH 小於 pI，帶正電往陰極。 胜肽可解離的基團包括游離 N 端、游離 C 端及可解離側鏈；已形成肽鍵的基團，不能再當作游離胺基或羧基計算。 磷酸化通常使 pI 降低；離胺酸、精胺酸等鹼性側鏈的比例增加，通常使 pI 升高。 電泳方向由淨電荷正負決定；電泳速度還受電荷量、分子大小、形狀及介質影響，須區分考題的簡化比較與實際情況。 核心觀念 一、等電點表示電荷平衡 蛋白質具有可接受或釋放質子的官能基，包括末端胺基、末端羧基，以及部分胺基酸的側鏈。環境 pH 改變時，這些基團的質子化程度隨之改變，使蛋白質的淨電荷發生變化。酸性環境較有利於接受質子；鹼性環境較有利於失去質子。 pI 是使蛋白質平均淨電荷為零的 pH 值。此時正電荷與負電荷互相抵銷，仍可同時存在帶正電的胺基與帶負電的羧基。因此，等電點不是時間、電壓，也不是所有側鏈都呈中性的狀態。 在一般理論電泳判斷中，蛋白質處於 pI 時，沒有由淨電荷造成的定向電泳移動；這不表示分子完全停止熱運動或擴散，也不表示它必須位於兩電極的正中央。 二、先比較 pH 與 pI，再判斷方向 環境條件蛋白質淨電荷電泳方向 pH > pI負電往陽極，即正極 pH = pI零無淨電泳移動 pH < pI正電往陰極，即負極 作答依序進行：找出環境 pH → 與各蛋白質的 pI 比較 → 判定淨電荷 → 依異性電荷相吸決定方向。同一緩衝液中的不同蛋白質，可能分別向兩極移動，也可能有某一蛋白質恰好處於等電點。 若環境 pH 介於兩種蛋白質的 pI 之間，較低 pI 者帶負電，較高 pI 者帶正電。若環境 pH 恰好等於其中一種蛋白質的 pI，該蛋白質淨電荷為零，不能判成往正極或負極移動。分子量相同也不會改變上述判斷。 這套規則適用於依蛋白質本身酸鹼性判斷電荷的情境。若題目另外加入會改變蛋白質帶電性質的處理，便須依該電泳方法判斷。 三、pH 梯度與等電聚焦 在等電聚焦中，陽極端為低 pH 區，陰極端為高 pH 區。蛋白質所帶電荷由所在位置的局部 pH決定，而非進入電泳槽後便維持固定電荷。 當局部 pH 低於蛋白質 pI 時，蛋白質帶正電，向陰極的較高 pH 區移動；當局部 pH 高於 pI 時，蛋白質帶負電，向陽極的較低 pH 區移動。兩種情況都使蛋白質朝向符合自身 pI 的位置聚集。 蛋白質到達 pH 等於 pI 的位置時，淨電荷為零，淨電泳移動停止。若因擴散離開該位置，便重新帶電，再被電場拉回，因此形成聚焦。 四、胜肽的可解離基團與 pKa pKa 描述個別可解離基團的酸鹼性，pI 描述整個分子淨電荷為零的條件。兩者意義不同。四胜肽雖由四個胺基酸組成，卻不能直接認定具有四個 pKa，也不能一律認定只有兩個。 一般未修飾的線性胜肽，應檢查游離 N 端胺基、游離 C 端羧基，以及各殘基是否具有可解離側鏈。內部殘基的 α-胺基與 α-羧基已參與肽鍵形成，不能當成游離末端基團計算。 以 Asp–Lys–His 三胜肽為例，各基團的判斷如下： 基團在此胜肽中的狀態 Asp 的 β-羧基為側鏈羧基，可解離而帶負電 Lys 的 ε-胺基為側鏈胺基，可接受質子而帶正電 Lys 的 α-胺基位於胜肽內部，已形成肽鍵，不作為游離胺基解離 His 的 α-羧基位於 C 端，仍為游離羧基，可解離而帶負電 此外，Asp 的 N 端胺基與 His 的咪唑側鏈也可參與酸鹼解離。判斷關鍵是基團的位置與是否形成肽鍵，不能只看胺基酸名稱。在胜肽的 pI 下，可確定的是整體淨電荷為零，不能據此認定其胺基不帶電。 五、磷酸化及胺基酸組成對 pI 的影響 磷酸化引入酸性的磷酸基，通常使蛋白質在相同 pH 下增加負電荷，需要更低的 pH 才能達到電荷平衡，因此磷酸化後 pI 降低。 離胺酸（Lys）與精胺酸（Arg）的側鏈可帶正電，其組成比例增加通常使 pI 升高；天門冬酸（Asp）與麩胺酸（Glu）的酸性側鏈比例增加，通常使 pI 降低。組織胺酸（His）的咪唑側鏈也可解離，會影響 pI。 甘胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸及色胺酸的側鏈，在一般蛋白質酸鹼判斷中不屬於主要可解離基團。比較胺基酸組成對 pI 的影響時，應優先注意具有可解離側鏈的胺基酸；離胺酸與精胺酸是典型的鹼性組合。 六、電泳方向與速度要分開判斷 電泳方向由淨電荷的正負決定，速度則與淨電荷量及移動阻力有關。在其他條件相近的簡化考題中，常以環境 pH 偏離 pI 的程度，粗略比較帶電程度：離 pI 較遠，通常視為淨電荷絕對值較大，泳速較快。 例如在中性緩衝液中，比較兩種 pI 均低於環境 pH 的蛋白質，兩者都帶負電並往陽極；依上述簡化判斷，pI 較低者偏離等電點較遠，預期較快。比較兩種 pI 均高於環境 pH 者，兩者都帶正電並往陰極，則 pI 較高者預期較快。 實際上，僅憑 pI 無法精確計算或保證泳速排序。不同蛋白質的電荷變化、大小與形狀可能不同；作答時須辨認題目是否採用其他條件相近的簡化前提。 常考陷阱 「正電往正極、負電往負極」：錯。異性電荷相吸，正電往陰極，負電往陽極。 「pI 大於 pH，所以帶負電」：錯。此時環境較酸，蛋白質帶淨正電。 「在 pI 時，所有胺基或側鏈都不帶電」：錯。只有正、負電荷總和為零。 「蛋白質整體帶負電，所以 N 端一定不帶正電」：錯。整體電荷與個別基團的電荷不可混為一談，末端狀態須看其 pKa 與環境 pH。 「由 pI 與 pH 就能判定是否溶於水」：錯。溶解度還受多種因素影響；接近 pI 時常較低，也不代表必然完全不溶。 「每個胺基酸都保留游離 α-胺基與 α-羧基」：錯。形成肽鍵後，應重新辨認末端與側鏈。 「磷酸化使 pI 升高」：錯。增加酸性磷酸基，通常使 pI 降低。 記憶口訣 高 pH、負電往陽；低 pH、正電往陰；等於 pI，淨電歸零。「高、低」都是相對於該蛋白質的 pI。 肽鍵先扣除，末端側鏈留；磷酸往下降，鹼性往上升。