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學習重點 MALDI 負責離子化：待測物與基質共同結晶，由基質吸收雷射能量，協助待測物脫附並形成氣相離子。 TOF 負責分析質荷比：全名為 time of flight，直接記錄離子飛行時間，再換算質荷比 m/z，不是離子化所需時間。 掌握臨床微生物鑑定用途：MALDI-TOF 可利用菌體蛋白質的質譜指紋鑑定細菌；相較之下，病毒較不適合以此作為常規鑑定工具。 區分蛋白質分離與質譜分析：二維電泳分離蛋白質；蛋白質點經消化後，以 MALDI-TOF 量測胜肽離子的飛行時間。 掌握分子量測定的準確性：比較 SDS-PAGE、等電點聚焦、體積排除層析與質譜法時，以質譜法測定蛋白質分子量最準確。 核心觀念 一、MALDI 與 TOF 的功能分工 MALDI 是 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，中文為「基質輔助雷射脫附／離子化法」；TOF 是 Time of Flight，中文為「飛行時間法」。MS 則代表質譜分析。整體流程可理解為：先使待測物形成離子，再依離子的飛行時間分析其質荷比。 部分功能判斷關鍵 MALDI 離子源協助待測物脫附並形成氣相離子基質吸收雷射能量 TOF 質量分析器依離子飛行時間區分質荷比由時間換算 m/z 偵測器記錄離子到達的時間與訊號強度形成質譜訊號 離子源與質量分析器是不同部分。TOF 並非 MALDI 專用，也能搭配電噴射離子化（ESI）等其他離子源。因此，不能將 MALDI-TOF 的常見組合誤認為唯一組合。 二、MALDI 的基質與雷射作用 分析時，將待測物與基質混合並共同結晶。雷射照射後，基質吸收能量，協助待測物由樣品表面脫附並離子化。在常見的紫外光雷射 MALDI 系統中，須使用能吸收該紫外光波長的基質。 作答時應掌握「基質輔助」的意義：不能把原理簡化成待測物直接接受雷射能量而離子化。MALDI 屬於軟性離子化，通常可減少待測分子的過度碎裂，適合蛋白質、胜肽等分子的分析；軟性離子化也不代表完全不會產生碎片。 三、TOF 量測飛行時間，再推算質荷比 離子經加速後進入飛行區，在相同加速電位與飛行距離等條件下，質荷比越小，飛行時間越短；質荷比越大，飛行時間越長。比較的依據是質荷比，不能忽略電荷數而只比較質量。 TOF 的直接量測值是離子到達偵測器所需的飛行時間，儀器再經校正換算為 m/z。它不是測量雷射照射多久，也不是測量待測物完成離子化所需的時間。 飛行時間：直接記錄的時間資訊。 質荷比 m/z：離子質量與電荷數的比值，由飛行時間換算。 分子量：由離子質荷比配合電荷數及加成離子等資訊推得。 MALDI 的蛋白質或胜肽訊號常以單電荷離子為主，因此 m/z 與分子量的數值可能接近，但兩者並非無條件相等；仍須考慮質子或其他加成離子的質量。 四、微生物鑑定與可分析的分子 臨床細菌鑑定可取培養所得菌落，經適當前處理及基質點樣後進行 MALDI-TOF 分析。菌體內多種蛋白質形成特徵性的質譜圖，再與參考資料庫比對，協助判定菌種。這是利用蛋白質質譜指紋進行鑑定，不是直接讀取微生物的核酸序列。 MALDI-TOF 可用於細菌及部分酵母菌、其他真菌的鑑定，結果也受樣品處理與資料庫涵蓋程度影響。若比較病毒、細菌、蛋白質與醣類，病毒較不適合作為常規 MALDI-TOF 鑑定的對象。病毒的樣品取得、純化、宿主成分干擾及資料庫等條件，使其常規應用較受限制；這不代表病毒完全無法接受質譜研究。 蛋白質與醣類皆可使用 MALDI 質譜分析。醣類可依分析目的選擇適合的基質、前處理或衍生化條件，不能因為不是蛋白質就判定無法分析。 五、二維電泳後的蛋白質點分析 蛋白質二維電泳通常先以等電點聚焦依等電點分離，再以SDS-PAGE主要依分子大小分離，於膠體上形成蛋白質點。取出目標點後，可用蛋白酶消化成胜肽，再以 MALDI-TOF 分析胜肽質量，與資料庫比對以輔助蛋白質鑑定。 因此，電泳階段可觀察蛋白質在膠上的位置或移動距離；進入 MALDI-TOF 階段後，所量測的是蛋白質片段形成的離子之飛行時間，再推算質荷比。基質吸附強度與自基質解離的程度，都不是 TOF 的量測指標。 六、蛋白質分子量測定方法比較 方法主要依據分子量判讀重點 SDS-PAGESDS 使蛋白質具有近似一致的電荷／質量比，主要依大小分離與標準蛋白比較，估計表觀分子量；可能受異常遷移影響 等電點聚焦（IEF）蛋白質移動至其等電點所在的 pH 位置主要判讀等電點，不是直接測定分子量 體積排除層析（SEC）分子的水動力大小及進入填料孔洞的程度經標準品校正估算分子量，受形狀及聚集狀態影響；大分子通常較早流出 質譜法（MS）分析離子質荷比，再換算分子質量在上述方法中，測定分子量的準確性最高 例如約 50,000 Da 的蛋白質，若要求在這些方法中選出分子量測定最準確者，應選質譜法。SDS-PAGE 與 SEC 主要由分離行為間接估計，IEF 則以等電點為分離依據。 常考陷阱 「TOF 是 time-of-fraction」：錯誤；正確為 time of flight，關鍵字是「飛行」。 「TOF 是待測物離子化所需時間」：錯誤；它記錄離子形成並加速後的飛行時間。 「待測物直接吸收雷射而離子化」：不符合 MALDI 的核心描述；應掌握基質吸收雷射能量並協助離子化。 「TOF 只能分析 MALDI 產生的離子」：錯誤；TOF 可搭配不同離子源。 「較重的離子一定較晚到達」：須先考慮電荷數；一般判斷應比較 m/z。 「二維電泳後以 MALDI-TOF 測片段移動距離」：混淆技術階段；TOF 量測的是離子飛行時間。 「病毒與醣類都不能用 MALDI 分析」：錯誤；病毒較不適合常規鑑定，醣類則可在適當條件下分析。 「等電點聚焦能最準確測分子量」：錯誤；IEF 看等電點，所列方法中以質譜法測分子量最準確。 記憶口訣 「基質吸光助帶電，飛行計時算質荷。」 「細菌比指紋，病毒非常規；聚焦看電點，質譜測量準。」